近期，首都医科大学附属北京佑安医院郑素军教授科研团队在国际期刊Cell death&Discovery(IF=7.0)发表了题为“ATP7B R778L mutant hepatocytes resist copper toxicity by activating autophagy and inhibiting necroptosis”的学术论文。该研究首先利用慢病毒转染构建了稳定表达ATP7B R778L突变细胞模型，在此模型基础上探究了ATP7B R778L突变细胞抵抗铜毒性的机制。

研究发现了坏死性凋亡在WD发病过程中起到关键作用，抑制坏死性凋亡可以减轻铜对细胞造成的损伤。此外，研究发现了激活自噬可以通过ATG16L1/ULK1-RIPK1/RIPK3/MLKL通路抑制坏死性凋亡。激活自噬、抑制坏死性凋亡可以减轻铜毒性。该结果为亚洲WD患者研究提供了更为理想的模型，也为未来WD的治疗提供了新的可能有效靶点。

首都医科大学附属北京佑安医院博士研究生汤珊、梁晨为本研究的共同第一作者，郑素军教授、白丽副教授为共同通讯作者。

Wilson病(wilson disease, WD)，是一种常染色体隐性遗传病。该疾病是由于编码铜跨膜转运蛋白的ATP7B基因发生突变，导致铜蓝蛋白合成及铜排泄过程发生障碍，使过量的铜沉积于肝脏、大脑、肾脏、角膜等组织器官中，从而引起神经系统症状、肝硬化、精神改变等不同的临床表现到目前为止，已有800多种引起疾病的ATP7B基因突变被鉴定。第8外显子的点突变R778L是亚洲患者中最常见的ATP7B基因突变。但是目前并没有针对ATP7B R778L突变的细胞/动物模型。

WD药物治疗策略的核心是促进铜的排出和减少铜的吸收。目前用于治疗WD的药物主要分为2类。一类为金属螯合剂，通过络合细胞内的铜，使之进入血循环，随尿液排出体外，从而减少铜在体内多个脏器的沉积。另一类药物为锌盐，可诱导肠上皮细胞中金属硫蛋白的合成，从而抑制铜经肠道吸收。

然而，WD的药物治疗存在一些局限性。例如，患者需要终生服药；可能会引起神经系统症状恶化；部分患者会出现与药物相关的不良事件或严重不良事件等。对于药物治疗无效的WD患者，可以进行肝移植治疗。

然而肝移植治疗亦有局限性。一是肝移植后需要终生免疫抑制，通常仅用于急性肝衰竭或失代偿期肝硬化患者;二是肝移植患者可能会出现神经系统症状加重。

因此，本研究的目的是探索ATP7B R778L突变的肝细胞应对铜毒性的新机制，以期获得针对WD的治疗新靶点。

本研究首先利用慢病毒转染的方法建立了ATP7B R778L点突变的HepG2稳转细胞系。该模型的ATP7B R778L的mRNA表达和蛋白水平均高于野生型HepG2细胞（图1）。

图1. ATP7B R778L突变型HepG2稳转细胞系的建立

为了研究铜超载对ATP7B R778L HepG2细胞自噬和坏死性凋亡的影响，研究使用硫酸铜对细胞进行处理。结果显示CuSO4处理后的细胞自噬和坏死性凋亡相关标志物均显著升高。在RIPK1、RIPK3或MLKL抑制剂处理后，坏死性凋亡相关的信号分子明显下调，细胞活力显著提升。

图2. 铜超载诱导ATP7B R778L HepG2细胞发生自噬和坏死性凋亡

为了进一步分析自噬与坏死性凋亡之间的密切关系，研究在ATP7B R778L细胞中进行了自噬激活和抑制实验。结果显示spautin-1显著降低了CuSO4激活的LC3B、ULK1和ATG16L1的基因水平，且促进了坏死性凋亡相关标记物的表达。雷帕霉素（一种经典的自噬激活剂）可以进一步激活CuSO4处理的细胞自噬水平，抑制坏死性凋亡（图3）。因此，自噬激活可通过抑制坏死性凋亡来抵抗铜诱导的细胞毒性。

图3.自噬激活抑制坏死性凋亡抵抗铜毒性

研究最后探究了自噬抑制R778L细胞坏死性凋亡的分子机制，并重点关注ULK1和ATG16L1。结果显示在ULK1和ATG16L1过表达的细胞中观察到坏死性凋亡相关标记物的mRNA及蛋白质水平降低。在ULK1和ATG16L1特异性抑制的细胞中观察到坏死性凋亡相关标记物的升高（图4）。因此，ULK1和ATG16L1的自噬信号分子介导了坏死性凋亡的抑制。

图4. ULK1和ATG16L1的自噬信号分子介导了坏死性凋亡的抑制

综上所述，本研究通过建立新的WD细胞模型，证明激活自噬可以保护肝细胞对抗 RIPK3和MLKL介导的坏死性凋亡。该研究为亚洲WD患者人群的发病机制提供了新的见解和有希望的可能治疗靶点。

第一作者简介

汤珊

首都医科大学附属北京佑安医院内科学博士研究生在读；University of Oxford Microbiology and Cell science专业联合培养，研究方向为遗传代谢性肝病。以第一作者发表SCI论文9篇，中文核心期刊5篇，并多次在AASLD、APASL、中华肝病学会等国内外学术会上做壁报展示。

通讯作者简介

郑素军

●医学博士，主任医师，教授，首都医科大学博士研究生导师

●首都医科大学附属北京佑安医院肝病中心一科主任

●佑安肝病感染病专科联盟办公室副主任

●北京市科技新星，北京市高层次卫生人才，北京市卫生局“十百千卫生人才”百层次人才

●中华医学会肝病学分会肝炎学组委员，中华医学会肝病学分会遗传代谢性肝病协作组委员、秘书长，北京医学会肝病委员会委员，佑安专科联盟遗传代谢性肝病专业委员会主任委员，中国研究型医院学会肝病专委会肝纤维化学组委员、北京医学会肝病学分会人工肝与肝衰竭学组委员、北京医学会肝病学分会青年委员会委员，北京医学会临床流行病学与循证医学分会青年委员，国家自然基金评审专家，“健康中国-肝胆病防治行动”全国肝胆病咨询专家，北京医药科学技术发展协会生物医药专家。